PENGGUNAAN GEN GH SEBAGAI MARKA MOLEKULER DNA GURAMI (Osphronemus Goramy) DALAM PENGEMBANGAN TEKNOLOGI SURROGATE BROODSTOCK
PENDAHULUAN
Teknologi
transplantasi sel germinal ikan telah dikembangkan baru-baru ini untuk
merekayasa produksi benih ikan melalui induk "semang" atau surrogate
broodstock (Okutsu et al, 2006a). Teknologi induk semang tersebut dilakukan
dengan cara mentransplantasikan sel germinal berupa primodial germ cells (PGC)
(Takeuchi et al, 2006b) kedalam rongga perut larva ikan resipien, selanjutnya
sel donor berdiferensiasi menjadi telur atau sperma. Keberhasilan teknologi ini
telah ditunjukan pada ikan trout pelangi menggunakan induk semang salmon masu
(Takeuchi, 2004), teknik ini bepotensi digunakan untuk merekayasa produksi
benih budidaya di Indonesia, khususnya ikan yang matang gonadnya relatif lebih
lambat seperti ikan gurami.
Penelitian ini
merupakan teknik alternatif yang telah dilakukan untuk mengidentifikasi ikan
gurami sebagai donor dan ikan nila sebagai recipient dengan mesin PCR
menggunakan Growth Hormone (GH) sebagai marka molekular pendeteksi DNA gurami
yang dicampur dengan DNA nila sebagai pendekatan dalam mendeteksi sel gonad
donor dalam individu recipient. Aplikasi teknologi transplantasi sel germinal
gurami pada ikan semang yang cepat matang gonad dapat mengatasi masalah
keterlambatan ikan gurami dalam proses pematangan gonad. Hal ini dapat mendukung
peningkatan produksi benih gurami secara signifikan di masa mendatang.
Identifikasi sel
donor dalam inividu ikan recipient umumnya dilakukan dengan cara mengamati
pendaran sel yang mengekspresikan gen GFP menggunakan mikroskop flouresense.
Saat ini ikan gurami ikan gurami yang transgenik yang memiliki sel
germinal mengekspresikan gen GFP belum tersedia, karena waktu matang gonad ikan
gurami secara alamian cukup lama, maka waktu yang digunakan untuk membuat
gurami transgenik juga belum diketahui. ketersediaan mikroskop
flouresense yang masih terbatas di Indonesia juga merupakan kendala
penggunaan sel berpendar sebagai donor.
Kendala tersebut membuat
penelitian ini menggunakan alternatif untuk identifikasi sel donor menggunakan
gurami bukan transgenik. Metode yang mungkin diaplikasikan di Indonesia saat
ini adalah marka molekular DNA yang dapat dideteksi dengan metode PCR
menggunakan primer spesifik bagi ikan donor. mesin PCR sudah tersebar di
seluruh Indonesia. Primer spesifik didesain dari sekuen gen target ikan donor.
Pda gurami, sekuen gen yang tersedia adalah gen penyandi hormon pertumbuhan
(Growth Hormone), gen GH tersebut dikembangkan sebagai marka molekular
pendeteksi DNA ikan gurami yang dicampur dengan DNA ikan nila sebagai pendekatan
dalam mendeteksi sel gonad donor dalam individu recipient.
BAHAN DAN METODE
- Desain Primer untuk Marka Molekular
Penyejajaran sekuens dilakukan dengan menggunakan program GENETYX versi 7,
untuk memperoleh area potensial sebagai primer forward dan reverse sebagai
marka molekular penanda sel gonad gurami. Beta aktin sebagai kontrol internal
loading DNA dalam amplifikasi PCR.
- Ekstraksi DNA Genom
- DNA diekstraksi dari jaringan sirip menggunakan kit isolasi DNA.
- Inkubasi untuk proses lisis sel dilakukan pada suhu 55 derajat celcius selama semalam.
- RNase (4mg/ml) sebanyak 1,5 ml ditambahkan kedalam mikrotub berisi sel yang telah terfisis dan selanjutnya di inkubasi pada suhu 37 derajat celsius selama 60 menit.
- Protein diendapkan menggunakan protein precipitasion solution 100 ml dan disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 15 menit.
- Supernatan dipindahkan ke dalam mikrotub yang berisikan 30 ml isopropanol, dan DNA diendapkan dengan sentrifugasi kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit.
- Supernatan dibuang dan selanjutnya pelet DNA dicuci dengan etanol 70% sebanyak 300ml.
- Setelah dikeringkan, DNA dilarutkan dengan 30ml ion exchange water.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Primer spesifik adalah adalah primer yang dapat mengenali sekuense berdasarkan
cetakan DNA target, sementara skuens dengan cetakan DNA dari ikan lain tidak
dapat dikenali. Produk PCR dengan cetakan dari DNA gurami mengasilkan pita
dengan panjang sekitar 340 bp, sedangkan DNA dari ikan nila tidak dapat
diamplifikasi. Dengan demikian, primer spesifik GH dapat menjadi marka
molekular untuk membedakan ikan donor dan ikan recipient. dan menjadi
alternatif marka untuk mendeteksi sel germinal gurami yang ditransplantasikan.
Agar sel germinal yang berkoloni dalam gonad individu dapat dideteksi oleh
marka, maka dperlukan pencampuran sel donor dan sel recipient. Sebagai
pendekatan terhadap pencampuran sel sel donor dan sel recipient tersebut,
dilakukan pencampuran DNA hasil ekstraksi dari gurami dan nila. Hasil pengujian
sensitifitas PCR menunjukan bahwa konsentrasi pencampuran DNA gurami dan nila
yang paling rendah yang dapat dideteksi adalah 1.700mg/ml DNA nila.
Selanjutnya, semakin kecil rasio perbandingan konentrasi pencampuran DNA maka
semakin tipis fragmen DNA yang dihasilkan.
KESIMPULAN
- Marka GH spesifik dapat dijadikan sebagai penanda untuk mengidentifikasi sel germinal donor (Ikan Gurami) di dalam recipient (Ikan Nila).
- Konsentrasi minimum DNA gurami dalam 7000 mg/ml DNA Nila yang dapat dideteksi adalah 1mg/ml
